生物学基础三项？审核员关注哪些？

在申请510(K)时，最常碰到的生物学测试主要为三项，细胞毒性，刺激和致敏，也就是我们经常说的生物学基础三项。

我们来聊一聊FDA审核员在审核细胞毒性测试报告时主要在看测试报告中什么内容。

细胞毒性依据的标准是ISO 10993-5，一般我们建议实验室出具符合GLP的报告，审核员在拿到报告后会在报告中重点关注下列内容:

(一般用于510(k)申请的报告都为英文，所以为了能让大家在英文报告中找到对应内容，这里我们使用英文相关术语，避免歧义):

1.细胞毒性测试的类型。主要的实验类型有两种：

包括Direct Contact Method, Extraction Method (MEM Elution)。或者其它方法。

FDA当前推荐适用MEM方法，也就是上述的Extraction Method (MEM Elution). 如果实验使用了其它方法，那么FDA需要提供使用其它方法的合理性解释；

2.实验样品信息，报告中需要包含用于此次实验样品的信息，比如部件名称，材料名称等；

3.Extraction Conditions

a. Extraction Vehicle

浸提介质一般包括Culture medium with 5-10% serum, Culture medium without serum, Physiological saline solution,或者其它。

FDA当前推荐使用Culture medium with 5-10% serum。如果使用其它浸提介质，需要给出合理的解释。

b.Extraction Conditions

浸提条件一般包括37℃ for 24 hr, 37℃ for 72 hr, 50℃ for 72 hr, 70℃ for 24 hr, 121℃ for 1 hr, 或者其它浸提条件。

FDA当前推荐使用37℃ for 24 hr, 或者37℃ for 72 hr。如果使用其它条件，则需要给出合理的解释。

FDA主要担心过高的浸提温度可能会造成细胞培养基中蛋白质完整性的丧失，进而影响测试结果的有效性。

至于37℃ for 24 hr 和37℃ for 72 hr的条件具体选择24小时还是72小时呢，我们可以基于器械预期用途来判定，如果器械使用持续时间小于或等于24小时，则选择37℃ for 24 hr的浸提条件，否则则建议选择37℃ for 72 hr。

c.Was the test extract diluted, filtered, or was the pH adjusted?

FDA当前建议在报告中明确包含浸提液状态的描述，此描述应可以清洗的说明浸提液是否在使用前经过稀释，过滤或者调节pH值。

FDA期待的描述中，应该清楚的表明，浸提液在使用前没有经过上述处理。

d.Study Controls

研究对照设计，一般包括Positive Control only, negative control only, vehicle control only, 或者上述两种对照。

FDA当前推荐使用Positive Control, negative control, vehicle control全部三种对照。如果不是，那么需要给出合理的解释。

e.Extract/Test Article is clear

FDA当前建议在报告中包含对浸提物质的状态进行描述，浸提介质中的测试样本是否清晰，比如不浑浊，没有颗粒，没有颜色改变，没有膨胀或者降解.

FDA期待的描述中应该如上述所列，没有这些情况出现。

f.Extract Storage Conditions

浸提溶剂的存储条件包括两种Used by 24 hrs post-extraction, 和Stored (>24 hrs)。也就是浸提后的溶剂是否在24小时内使用。

FDA当前建议浸提后的溶剂需要在24小时内使用，否则需要给出合理的解释，并提供使用存储了24小时后的浸提溶剂进行实验对结果没有影响的证据。

一般建议浸提后立即使用。

4.Methods

a. Test System

FDA当前推荐的实验细胞毒性的实验系统为L-929 Mouse Fibroblasts (monolayer), 如果不是此实验系统，则需要提供替代细胞类型的描述，并给出合理的解释。

b. Assessment Times After Treatment

FDA当前推荐的评价时间为37℃ for 48 hr minimum, 如果使用的不是推荐时间，则需要给出具体的所使用的评价时间，并给出合理的解释为什么可以接受此时间。

对于植入物，72小时是合适的。

c. Was the following scale used for test extract, reagent control, negative control and positive control?

0: discrete intracytoplasmic granules & no lysis

1: occasional lysed cells (0-20% cells rounded, loose)

2: no extensive cell lysis (20-50% cells rounded)

3: 50-70% lysis (50-70% cells rounded)

4: nearly complete destruction of cell layer (>70% lysis)

FDA当前推荐使用上述评分系统对样品浸提物以及对照品进行打分评价。如果使用的不是此方法，则需要给出所使用评价方法合理性的解释。

注意，此处0代表noncytotoxic, 1或2代表测试样品需要根据制造材料来确定是否可以接受，3或4代表cytotoxic，也就是有毒。

d. Were there deviations?

FDA当前建议报告中明确结果是否存在偏差，如果存在，则需要提供解释，为什么此偏差不会影响结果的有效性。

5.Results

a. Were there any cell abnormalities?

FDA当前建议报告中明确描述是否存在任何形式的细胞异常。如果存在，需要描述此异常。

b. Were cytotoxicity scores in the controls as expected?

FDA当前建议报告中明确描述对照组的细胞评分是否符合预期，如果不符合预期，则需要提供解释为什么不符合预期的对照组评分不会影响测试结果的有效性。

6.Conclusion

Cytotoxic Potential

FDA当前建议报告中明确关于潜在毒性的测试结论，实验结论一般包括non-cytotoxic (Grade 0), non-cytotoxic (Grade 1 or 2), Cytotoxic (Grade 3 or 4).

如果是后两项结论，则需要给出为什么此结论不会影响产品的安全性。

如果提交的细胞毒性测试报告，包含了上述6条涉及的内容，并且也符合FDA对此项内容的预期，则FDA审核员会很快的结束细胞毒性的审核；如果报告包含了上述6条涉及的内容，但是其内容不符合FDA的预期，则FDA审核员会花更多时间来审核给出的解释，或要求提供解释。

总之，在提交前，甚至测试前，充分和实验室沟通，确保报告包含这些要素，并且取得符合FDA预期的结果，则细胞毒性的审核将会以最快的速度完成。

后续，我们会根据我们的审核经验，针对510(k)提交中各个审核要点，陆续制作一些列的内容，希望可以减少大家在510(k)审核过程中花费的事件，并尽可能的避免一些不必要的问题。